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Nachweis von Alicyclobacillus acidoterrestris Sporen in Fruchtsäften

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Released Saturday, 6th February 2016
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Die acidophilen und thermoresistenten Sporenbildner des Genus Alicyclobacillus spielen aufgrund der Bildung von Fehlaromen eine wichtige Rolle als Verderbserreger von Fruchtsäften, wobei dem Guajacol-produzierenden A. acidoterrestris eine besondere Bedeutung zukommt. Um den einfachen, schnellen und zuverlässigen Nachweis von A. acidoterrestris Sporen in verschiedenen Fruchtsäften zu ermöglichen, sollten erstmals spezifische poly- und monoklonale Antikörper (pAK und mAK) entwickelt und darauf basierend hochsensitive und selektive immunchemische Nachweisverfahren etabliert werden. Um eine umfassende und verlässliche Charakterisierung der entwickelten Antikörper zu gewährleisten, wurde eine Alicyclobacillus spp. Stammbibliothek (n = 61) aufgebaut. Die Identifizierung der Isolate erfolgte nach mikrobiologischen Kriterien sowie mittels Real-Time PCR, RAPD-Analysen dienten zur weiteren Differenzierung. Ein Pool aus vier verschiedenen, mittels Paraformaldehyd inaktivierten A. acidoterrestris Stämmen wurde zur Immunisierung von Kaninchen und Mäusen verwendet. Die spezifische Bindung der induzierten pAK an die Sporen konnte mittels Immunfluoreszenz bestätigt werden. Basierend auf den generierten polyklonalen Kaninchenseren wurde ein sensitiver Sandwich Enzymimmuntest (EIA) aufgebaut, die Nachweisgrenzen lagen bei durchschnittlich 5,0 x 10^3 Sporen/ml für die DSM-Referenzstämme, sowie 2,1 x 10^3 – 3,8 x 10^4 Sporen/ml für die untersuchten 38 A. acidoterrestris Isolate. Unter Verwendung der Stammbibliothek und weiterer aerober sowie anaerober Sporenbildner konnte die hohe Inklusivität sowie Exklusivität des Verfahrens bestätigt werden: Alle A. acidoterrestris Stämme wurden als positiv erkannt, während die meisten anderen Alicyclobacillus spp. Stämme, sowie die Vertreter von Nicht-Alicyclobazillen keine Reaktivität zeigten. Anwendungsstudien zeigten die Einsetzbarkeit des pAK-basierten EIA für den direkten Nachweis von Sporen in verschiedenen Fruchtsäften. Nach 48 stündiger Anreicherung der in BAT-Bouillon verdünnten und mit 1 Spore/ml künstlich kontaminierten Proben bei 45 °C konnte in allen untersuchten Fruchtsaftsorten reproduzierbar und zuverlässig A. acidoterrestris nachgewiesen werden. Auch die 16 generierten mAK reagierten entweder in indirekten oder Sandwich EIAs z. T. hochaffin mit Sporen von A. acidoterrestris, mit Nachweisgrenzen von 5,0 x 10^2 – 4,0 x 10^5 Sporen/ml. Ein etablierter mAK-basierter Sandwich EIA wies eine hohe Inklusivität und Exklusivität auf. Mittels Immunoblot konnte für 12 mAK eine ausgeprägte Reaktivität mit Sporenproteinen gezeigt werden, die reaktiven Banden lagen bei ca. 14, 50 bzw. 66 kDa.

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